如何利用荧光显微镜检测细胞凋亡 实验步骤有哪些
1、收集约106细胞,用冷PBS洗2次。
2、4%福尔马林4℃固定10min左右后涂片,晾干。
3、以5-10μg/mL hocchst 33258染色5-10min,水冲净,晾干后观察,以紫外光(340nm)激发hocchest。
4、细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
5、细胞凋亡有别于细胞坏死,它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变,包括出现染色体浓缩、DNA降解、凋亡小体的形成等。在正常的活细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜内侧,但在凋亡细胞中,PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中,Annexin-V(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca2+的依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-V进行荧光素(如FITC 、PE)或生物素(biotin)标记,以标记了的膜联蛋白-V作为探针,利用荧光显微镜检测细胞凋亡的发生。
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